将体温维持在一个狭窄的范围内对于温血动物来说至关重要。在啮齿类动物中股票配资10万一年利息多少，下丘脑的视前区（POA）能检测并调节核心体温。然而，关于灵长类动物体温调节中枢的知识仍然有限。在此，我们表明，通过化学遗传学策略激活视前区神经元的一个亚群，能够可靠地在麻醉状态下和自由活动的猕猴中诱导体温过低。对生理参数的全面监测显示，这种体温过低伴随着自主神经变化，包括心率上升、骨骼肌活动增加，以及血液中相关生物标志物的变化。与体温过低期间活动量增加相一致的是，这些动物表现出一系列完整的寒冷防御行为。静息态功能磁共振成像证实了视前区的化学遗传学激活，并绘制出了全脑范围的体温调节网络。总之，我们的研究结果证明了灵长类动物体温的中枢调节机制，并为其在临床实践中的未来应用铺平了道路。

一、引言

为了生存，鸟类和哺乳动物必须积极调节它们的核心体温（Tcores），使其保持相对恒定，而不受环境温度变化的影响。专门的细胞类型和神经通路已经进化出来，以精确调节核心体温。据报道，大鼠视前区（POA）的永久性损伤或暂时失活会导致在炎热或寒冷环境中无法维持核心体温。局部加热视前区会在大鼠中引发体温过低和热防御反应。在小鼠中，借助化学遗传学和光遗传学工具，已经在视前区中鉴定出了各种对温度敏感的暖敏神经元（WSNs）的标志物，这些神经元能够感知外周和中枢的温度变化。2016 年，研究人员等报道称，共表达脑源性神经营养因子（BDNF）/ 垂体腺苷酸环化酶激活多肽（PACAP）的视前区神经元可以直接被环境温暖所激活。对这些神经元的光遗传学激活会降低小鼠的体温，并协调自主神经和行为体温调节反应。作为补充，研究人员等鉴定出了一种热敏感通道 —— 瞬时受体电位 M2（TRPM2），它标记了视前区内侧的暖敏神经元。对表达 TRPM2 的神经元或表达囊泡谷氨酸转运体 2（VGlut2）的神经元亚群的化学遗传学激活会在小鼠中引发严重且持久的体温过低。越来越多的数据支持这样一种观点，即视前区是一个热感知中心，刺激这个区域会促进散热。

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到目前为止，大多数关于体温调节神经基质的研究都使用小鼠作为动物模型。虽然小鼠是一种非常有价值的工具，但将从小鼠实验中得出的结果转化到临床实践中充满了挑战。例如，小鼠自然会进入蛰伏状态，并且能够耐受低至 18°C 的体温。它们体型小，表面积与体积之比较大，使得它们能够与环境快速进行温度交换。与小鼠不同，人类和其他大型动物（如非人灵长类动物）对体温变化的耐受性要弱得多。例如，体温过低（<35°C）和体温过高（40.5°C）都是医疗急症。这就提出了一个问题，即人类和啮齿类动物在体温调节的神经基质方面有多少共同之处。作为与人类亲缘关系最近的动物，非人灵长类动物（NHPs）可以弥合这一差距。在狒狒和松鼠猴中，对视前区 / 下丘脑前部的直接冷却或加热会改变体温。然而，这些实验没有涉及细胞类型特异性和行为反应。猕猴视前区作为大脑中的体温调节中枢，其功能在进化上是否保守仍然未知。

我们认为，以细胞类型特异性的方式激活猕猴的视前区，将为理解非人灵长类动物（最终是人类）的体温调节回路提供一个切入点。在此，我们报告称，对猕猴视前区兴奋性神经元的化学遗传学刺激能够可靠地诱导其体温过低。在非人灵长类动物中诱导出的体温过低伴随着介导热防御的自主神经和行为反应，尽管与小鼠的情况有很大不同。诱导体温过低后的静息态功能磁共振成像（fMRI）扫描揭示了全脑范围的体温调节网络。这些发现确定了视前区在非人灵长类动物体温调节中的关键作用，并揭示了啮齿类动物和灵长类动物之间保守的回路。

二、结果

01. 化学遗传学激活视前区导致体温过低

为了确定视前区在体温调节中是否发挥必要作用，我们使用化学遗传学策略来操纵视前区的神经活动。首先，将编码由钙调蛋白激酶 IIα（CamKIIα）启动子驱动的、仅由设计药物激活的兴奋性设计受体（兴奋性 DREADD，hM3Dq）表达的腺相关病毒（AAV），双侧注射到两只猴子的视前区，以在兴奋性神经元中选择性表达与 Gq 蛋白偶联的 DREADD 受体。安装在颅骨上的定制导向网格确保了在磁共振成像扫描和立体定向注射过程中能够一致地进行操作（图 1A）。为了实现可靠且稳定的核心体温记录，将温度记录仪植入实验猴子（CM33–EXP/CM34–EXP）的上腹腔和一只对照猴子（CM53–CON：未注射病毒）的上腹腔（图 1B）。植入的记录仪被编程为每隔 5 分钟记录一次温度，持续数月，且不干扰实验对象的日常活动。通过热成像测量这些实验对象的耳部表面温度（图 1C）。为了监测自主神经体温调节反应，在受限制的动物中记录心电图（ECG）、肌电图（EMG）和血压。采集血样进行一系列生化测试（图 1D）。

图 1. 猕猴实验装置示意图

(A) 定制设计的导向网格用于在磁共振成像扫描后，将病毒 AAV8-CamKII-hM3Dq 注射到双侧视前区。

(B) 将一块温度记录仪植入腹腔，以长期自动记录核心体温。

(C) 使用红外摄像机拍摄实验动物的表面温度。

(D) 采用包括心电图、肌电图、血压以及血样生化测试等多种测量方法来监测生理状态。

为了选择性激活视前区中表达 hM3Dq 的兴奋性神经元，在猴子的饲养笼中给它们肌肉注射相应的配体氯氮平 - N - 氧化物（CNO；10 毫克 / 千克）。在不同日期，在注射 CNO 之前和之后注射生理盐水作为对照。注射后，让实验对象自由活动。温度记录仪的记录显示，在两只实验猴子（CM33–EXP/CM034–EXP）中，注射 CNO 后核心体温迅速下降（图 2A 和 2B）。我们通过减去基线来计算核心体温变化量（ΔTc），发现注射后 20 至 240 分钟内，实验对象 CM33–EXP 和 CM34–EXP 的平均核心体温分别下降了−0.38°C ± 0.02°C（平均值 ± 标准误差）和−0.49°C ± 0.04°C。这些操作重复了四次，这两只实验对象的最大降温幅度分别为 1.32°C 和 1.73°C。注射生理盐水没有引起任何变化，因为 CM33–EXP 的平均温度变化为−0.01°C ± 0.02°C（与 CNO 条件相比，威尔科克森秩和检验，p < 0.001），CM34–EXP 的为 0.06°C ± 0.03°C（p < 0.001）。对于未注射病毒的对照实验对象（CM53–CON），CNO 引起了微小的温度变化（−0.06°C ± 0.03°C；图 2C），从统计学角度来看，这一变化小于 CM33–EXP 或 CM34–EXP 的降温幅度（p < 0.01）。因此，仅 CNO 不会改变核心体温。我们得出结论，实验对象的体温过低是由 CNO 与 DREADD 受体结合引起的。

图 2. 视前区兴奋性神经元的化学遗传学激活在自由活动和麻醉状态的动物中均诱导体温过低

(A–C) 两只实验对象（CM33–EXP 和 CM34–EXP）和一只对照实验对象（CM53–CON）在自由活动期间与基线相比的温度变化量，其中 x 轴和 y 轴分别表示时间和温度变化量。x 轴上的零表示注射时间，蓝色和棕褐色分别表示注射生理盐水和 CNO。阴影部分表示标准误差均值。

(D–F) 三只实验对象在麻醉状态下的温度变化量。棕褐色：CNO；蓝色：生理盐水。

由于活动量对核心体温有很大影响，我们试图通过研究麻醉状态下的动物来消除这一因素。在麻醉期间，由于实验对象被外部热源加热，注射生理盐水后（图 2D–2F 中的蓝线）它们的核心体温升高。有趣的是，与注射生理盐水相比，注射 CNO 使两只实验猴子的核心体温上升速度减慢（图 2D 和 2E 中的棕褐色线），而对照猴子在注射生理盐水和 CNO 后核心体温的上升情况相同（图 2F）。这一现象表明，视前区神经元的化学遗传学激活通过降低核心体温，对抗了外部加热。总之，在自由活动和麻醉状态的非人灵长类动物中，视前区神经元的化学遗传学激活在实验组中可靠地引发了体温过低。

02. 视前区的化学遗传学激活增强了活动量

行为是体温调节的一个关键组成部分。增加或抑制活动量是促进或抑制产热的一种策略。对于人类来说，抵御寒冷以维持体温的一种有效方法是通过运动来产生热量（例如跑步）。在啮齿类动物中，刺激视前区的暖敏神经元会导致体温过低，并伴随寻找温暖环境的行为。由于我们在两只实验对象中观察到了可靠的体温过低现象，接下来我们着手确定它们的行为反应。为了量化行为，让实验对象在一个由钢化玻璃墙制成的观察笼中自由探索。运动轨迹由商业分析系统的摄像机拍摄，并通过定制代码进行分析。在 3 小时的测试中，CM33–EXP 和 CM34–EXP 在注射 CNO 后比注射生理盐水后的移动距离更长（图 3A 和 3B）。定量分析表明，注射 CNO 后 3 小时内的总移动距离显著长于注射生理盐水后的总移动距离（CM33，p <0.001；CM34，p < 0.01，配对 t 检验；图 3C 和 3D）。作为对照，对于 CM53–CON，注射 CNO 没有引起移动距离的任何变化（p> 0.5；图 3E）。简而言之，CM033–EXP/034–EXP 在注射 CNO 后既降低了核心体温，又增加了活动量。而对照组（CM53–CON）则没有这种情况。

图 3. CNO 诱导的体温过低与活动量增加同时发生

(A 和 B) 实验对象 CM33 在注射生理盐水或 CNO 后在观察笼中的移动轨迹。x 和 y 位置对应从顶视图看观察笼的水平轴和垂直轴。每一列代表上方所标注的那一小时内的轨迹。

(C–E) 实验对象和对照实验对象在注射生理盐水（蓝色）或 CNO（棕褐色）后连续六个半小时的归一化移动距离的平均值。误差条表示标准误差。***p < 0.001；**p < 0.01。

03. 受限制动物的自主神经体温调节变化

我们假设，活动量的增加会产生热量，并补偿体温过低期间的热量损失。如果是这样的话，限制活动可能会使动物无法产生额外的热量，并且应该会进一步降低 CM33–EXP 和 CM34–EXP 的核心体温。

为了验证这一假设，我们让实验组（CM33/CM34）适应受限制的状态。由于对照动物（CM53）没有表现出依赖 DREADD 的体温过低现象，所以在受限制的实验中它被排除在外。在受限制的情况下，在注射 CNO 或生理盐水后 3 小时内监测表面温度、心电图、肌电图和血压。与自由活动的动物类似，两只猴子在注射 CNO 后核心体温迅速下降。在受限制的情况下，与注射生理盐水相比，核心体温分别下降了−0.69°C ± 0.03°C 和−0.91°C ± 0.03°C（图 4A 和 4B）。当比较受限制动物和自由活动动物的体温过低情况时，当活动量被禁止时，核心体温的下降幅度更大（分别为 0.38°C ± 0.02°C 和 0.49°C ± 0.04°C；图 2A 和 2B）。因此，这些结果表明，对视前区的化学遗传学刺激可靠地降低了受限制动物的核心体温，这与在自由活动状态下的效果一致。因此，限制活动量增强了体温过低的程度。

图 4. 实验对象在受限制状态下注射生理盐水和 CNO 后的温度变化

(A 和 B) 实验对象 CM33 和 CM34 被限制在猴椅上时与基线相比的核心体温变化量。蓝色和棕褐色分别代表生理盐水和 CNO 条件，阴影部分表示标准误差均值。第一条虚线表示注射时间，第二条虚线表示限制结束时间。

(C 和 D) 从 CM33 和 CM34 的红外图像中获取的耳部温度变化量（如插图所示）。棕褐色代表 CNO 条件，浅蓝色和蓝色分别代表 CNO 注射前 1 天和注射后 3 天的生理盐水注射。

在小鼠中，对视前区暖敏神经元的刺激通过降低躯干的表面温度以及通过血管舒张增加尾巴的表面温度来促进热量散失。我们发现猕猴耳朵的无毛皮肤适合进行一致的热成像。如图 4C 和 4D 所示，CM33 和 CM34 的耳朵表面温度在注射 CNO 后（棕褐色）下降。在注射 CNO 前 1 天（浅蓝色）和注射后 3 天（蓝色）注射生理盐水时，耳朵表面温度没有明显变化。

与体温过低同时发生的是，在记录时间段内，两只猴子的心率都大幅增加了 40–60 次 / 分钟（图 5A 和 5B 中的棕褐色线）。注射生理盐水没有产生类似的效果（图 5A 和 5B 中的蓝色线）。另一方面，虽然也每隔 5 分钟测量一次血压，但我们没有注意到这些实验对象有任何一致的变化（图 S1）。有趣的是，后肢表面电极的肌电图记录显示，注射 CNO 后出现了多个短暂的波纹状信号，与注射生理盐水的情况相比，这些信号在 40 赫兹以下的频段具有更高的功率（图 5C 和 5D）。肌电图中的低频信号与肌肉颤抖有关。活动量增加、心率加快和肌肉颤抖表明，CNO 诱导的体温过低通过行为和自主神经体温调节两种方式引发了寒冷防御反应。

图 5. 注射 CNO 后心率和肌肉活动的自主神经反应

(A 和 B) CM33 和 CM34 注射 CNO 或生理盐水后的心率变化量。棕褐色代表 CNO 条件，浅蓝色和蓝色分别代表 CNO 注射前 1 天和注射后 3 天的生理盐水注射。

(C 和 D) CM33 和 CM34 在 CNO 和生理盐水条件下的典型肌电图信号及相应的功率谱。

(E–G) 两个实验对象在生理盐水和 CNO 条件下血液中肌酸激酶、肌红蛋白和淀粉酶的水平。

与这些肌电图结果一致的是，对这些实验对象采集的血样进行的生化测试证实，注射 CNO 后肌酸激酶（图 5E）和肌红蛋白（图 5F）的水平大幅升高（完整的所有测试生物标志物列表见表 S1–S3），这种升高是暂时的，3 天后恢复正常。剧烈运动也会使心率、血液中肌酸激酶和肌红蛋白的水平升高。我们认为，非人灵长类动物体温调节中的寒冷防御成分类似于剧烈运动。因此，淀粉酶水平的升高（图 5G）可能表明胰腺过度活跃以平衡血糖。

04. 功能磁共振成像揭示的网络效应

为了在全脑范围内评估对视前区化学遗传学激活的神经反应，在全身麻醉下给实验对象注射 CNO 后进行功能磁共振成像扫描。计算诸如局部一致性（ReHo）、低频振荡幅度（ALFF）、分数低频振荡幅度（fALFF）和功能连接性（FC）等参数，以量化静息态功能磁共振成像信号。通过从结构图像中手动选择视前区作为感兴趣区域（ROI）（图 6A），不同实验对象的视前区 ReHo 信号如图 6B 所示。与对照 CM53 相比，CM33 和 CM34 在注射 CNO 后 10 分钟内视前区的 ReHo 迅速上升，并在整个记录期间保持在较高水平。注射 CNO 后视前区 ReHo 随时间的升高有力地支持了视前区神经元化学遗传学激活的成功。对于从图谱（112RM-SL）中选取的其他感兴趣区域，在标准空间中计算出的 CM33 和 CM34 所有感兴趣区域（n = 22）的平均 ReHo 值均强于 CM53（p < 0.001，配对 t 检验；图 6C），这表明视前区刺激导致了大脑的普遍激活。

图 6. 肌肉注射 CNO 后的静息态功能磁共振成像扫描结果

(A) 视前区感兴趣区域（ROI）选择示意图。

(B) 三只实验对象在注射 CNO 后 90 分钟内视前区的局部一致性（ReHo）动态变化。

(C) 三只实验对象所有纳入的感兴趣区域的平均 ReHo 值。***p < 0.001。

(D) 三只实验对象注射 CNO 后所有纳入的感兴趣区域的 ReHo 随时间的动态变化。

(E) 三只实验对象所有感兴趣区域之间的功能连接性（FC）。色条表示功能连接性强度。

(F) 与对照实验对象 CM53 相比，实验对象 CM33 和 CM34 的相对功能连接性强度。

(G) 每个感兴趣区域的平均相对功能连接性。绿色和黄色星号分别代表 CM33 和 CM34。

许多感兴趣区域的 ReHo 随时间的动态变化重现了视前区 ReHo 的变化（图 6D），特别是顶叶区域，包括顶下小叶（IPL；粗绿线）、顶叶（PL；粗蓝线）和初级躯体感觉皮层（S1；粗紫线）。鉴于这些区域在多感觉整合方面已被充分证实的功能，这种激活反映了动物有可能检测到了核心体温的变化。低频振荡幅度（ALFF）/ 分数低频振荡幅度（fALFF）没有显示出显著差异（图 S2）。

功能连接性是通过测量来自两个区域的脑信号之间的相似性来定义的。它揭示了两个脑区之间的功能连接性。功能连接性分析发现，与 CM53 相比，CM33 和 CM34 的脑区之间存在广泛的连接（图 6E），其中暖色和冷色分别表示正的和负的功能连接性。以 CM53 为参考，CM33 和 CM34 的相对功能连接性如图 6F 所示。CM33 和 CM34 之间的一些连接出乎意料地一致，例如，顶下小叶和颞上沟之间的功能连接性、脑岛皮层（IC）和初级躯体感觉皮层之间的功能连接性，以及环状沟（CS）和顶叶之间的功能连接性。为了更好地展示这些一致的变化，我们对 CM33 和 CM34 的平均相对功能连接性进行了排序（图 6G）。平均而言，环状沟连同附近的脑岛皮层显示出最大的相对功能连接性，这与脑岛皮层作为内感受中心的作用相符，内感受中心包括检测心跳、不适感和温度。

总之，静息态功能磁共振成像分析证实了视前区的特定激活，并发现了大脑中的一些功能连接。值得注意的是，内感受中心脑岛皮层及附近区域是最强连接的区域之一。

三、讨论

长期以来，视前区一直被认为是大脑的体温调节中枢。在小鼠大脑的视前区已经鉴定出了一组分子标志物，用于标记暖敏神经元（WSNs）。对小鼠暖敏神经元的刺激会引发热量散失和体温过低。我们已经表明，通过化学遗传学技术激活视前区的兴奋性神经元，能够可靠地在清醒和麻醉的猕猴中诱导体温过低。这是少数几个化学遗传学操纵导致强烈行为和自主神经变化的案例之一。与小鼠类似，视前区神经元协调行为和自主神经体温调节反应。与小鼠模型不同的是，视前区的激活会促进活动量增加、血管收缩、心率加快和肌肉颤抖，所有这些都指向一种寒冷防御机制。静息态功能磁共振成像揭示了脑岛皮层中的一个局部回路，这与其在内感受（对温度、心率和舒适感的感受）中的核心作用相一致。

我们的研究结果揭示了视前区作为体温调节 “散热” 中枢的共性和物种特异性作用。我们探索了人类体温调节的基础，并为未来从实验室到临床的转化研究铺平了道路。随着人们对载人航天飞行的热情日益高涨，我们的体温过低猕猴模型是迈向人工冬眠漫长道路上的一个里程碑。

01. 视前区兴奋性神经元的激活在非人灵长类动物中诱导体温过低

在小鼠中，光遗传学和化学遗传学研究与细胞类型特异性驱动线相结合，揭示了基因定义的神经元与其功能之间的因果关系。然而，由于非人灵长类动物中缺乏等效的驱动线，目前没有这样的策略来剖析由分子标志物标记的细胞类型及其在神经系统中的作用。一种替代方法是将驱动光遗传学或化学遗传学受体表达的细胞类型特异性启动子包装在腺相关病毒（AAV）中。研究人员使用编码酪氨酸羟化酶启动子驱动通道视紫红质表达的腺相关病毒，成功地操纵了非人灵长类动物中的多巴胺能神经元。在这里，通过用钙调蛋白激酶 II（CamKII）启动子限制 Gq-DREADD 受体的表达，我们主要针对野生型猕猴视前区的兴奋性神经元亚群。

视前区是一个高度异质的区域。因此，这种方法对于限制因注射 CNO 而激活的神经元群体尤为必要。早期研究报告称，冷却或加热非人灵长类动物的下丘脑前部会改变体温。通过引入具有细胞类型特异性启动子的化学遗传学工具，我们在非人灵长类动物体温调节领域实现了前所未有的细胞类型特异性。在小鼠中，研究人员报告称，对 20% 的兴奋性神经元（VGlut2+）进行化学遗传学刺激足以使小鼠的核心体温低至 28°C。与这一发现一致的是，对视前区兴奋性神经元（由 CamKII 启动子驱动）的化学遗传学激活也会在猕猴中诱导体温过低，尽管程度比啮齿类动物小。我们的发现支持视前区的兴奋性神经元在分子身份和功能上在进化上是保守的。

由于动物数量和磁共振成像的空间分辨率有限，我们既无法确定病毒表达的亚核定位，也无法排除视前区附近区域因病毒泄漏而受到影响的可能性。在视前区附近，终纹床核和下丘脑室旁核在啮齿类动物中被认为是自主神经和神经内分泌中枢。最近在小鼠中的研究表明，激活下丘脑室旁核中的 Brs3 + 神经元反而会升高核心体温，而在终纹床核中，不会改变核心体温。综上所述，在小鼠中，在附近区域中，视前区是能够在化学遗传学激活时引发热量散失的关键区域。

02. 视前区神经元在非人灵长类动物中协调行为和自主神经体温调节

在小鼠中，视前区暖敏神经元的激活会引发行为变化，包括不动和寻找温暖环境的行为，以及自主神经变化，如心动过缓。所有这些体温调节结果都是为了促进体温过低而协调的。相反，在非人灵长类动物中，对视前区的刺激会引发行为和自主神经的寒冷防御反应：活动量增加、血管收缩增强、肌肉颤抖和心动过速。总的来说，所有这些反应都是为了对抗化学遗传学诱导的体温过低。这为非人灵长类动物与啮齿类动物相比体温过低程度较轻提供了一种解释。另一种合理的解释是，灵长类动物已经进化出了某些神经通路来保护核心体温，而啮齿类动物中缺乏这种机制。这一假设得到了以下事实的支持：在灵长类动物中，只能很好地耐受核心体温的小幅度偏差，而小鼠在核心体温低至 18°C 的蛰伏状态下也能存活。在解剖学和功能层面上，啮齿类动物和灵长类动物之间缺乏对体温调节机制的比较研究，这需要进一步研究。此外，非人灵长类动物中看似较轻的体温过低可能是由于基于 DREADD 的化学遗传学激活效率相对较低所致。

03. 功能磁共振成像描绘了大脑中的热感觉网络

猴子视前区神经元的激活会导致体温过低，并且功能磁共振成像扫描显示离散的脑区会随之发生变化。其中，我们注意到边缘系统存在广泛的功能连接，包括脑岛皮层、环状沟、海马体和海马旁回。以上所有区域都与处理感知和情感信息有关。例如，脑岛皮层是内感受的枢纽，介导对温度和心率的感知。海马体的突触活动是温度依赖性的。我们认为，猴子能够高精度地感知不到 1°C 的核心体温变化，作为回报，它们会协调一系列的寒冷防御行为。化学遗传学操纵与功能磁共振成像相结合，为开始研究特定细胞类型与其对整个大脑的影响之间的因果关系提供了一种手段。

04. 麻醉对体温调节的影响

在全身麻醉期间，体温调节会受到损害，体温过低很常见。例如，在麻醉期间，不仅感觉输入，而且运动输出以及交感神经功能都会向抑制状态转变。因此，在全身麻醉下，动物不太可能调动体温调节效应器官，如骨骼肌，更不用说执行寒冷防御行为了。对人类的研究表明，当身体暴露在寒冷的手术室环境中并使用寒冷的手术皮肤准备溶液时，体温会以 0.5°C–1°C / 小时的低速下降。在本研究中，各实验阶段的记录条件保持恒定，如麻醉深度和外部加热情况。然而，我们检测到了严格依赖 DREADD 的对外界加热的拮抗作用。此外，功能磁共振成像分析表明，麻醉不会在对照组中诱导出与实验组相当的 ReHo 信号，功能连接性也不会。总之，尽管麻醉会干扰体温调节，但激活视前区会引发热量散失。

四、材料与方法

01. 动物

本研究涉及三只食蟹猴（猕猴属）（雄性，1–3 岁，体重 2–2.3 千克）（请注意，由于实验猴短缺，我们无法对更多实验对象进行实验）。所有猴子都饲养在一个获得实验动物护理评估和认证协会认可的灵长类动物设施中，该设施具有环境控制（环境温度：24°C ± 1°C，相对湿度：50% ± 5%），猴子在那里可以获得充足的食物、水和专业的兽医护理。所有实验均在环境温度下进行。所有实验程序均按照《实验动物护理和使用指南》（第八版，2011 年）中规定的指南，经中国科学院深圳先进技术研究院机构动物护理和使用委员会批准（批准案例 ID：SIAT-IACUC-200103-NS-WH-A0999）。

02. 手术和病毒注射

所有手术程序均在实验对象麻醉状态下使用无菌方法进行。对于全身麻醉，首先给猴子注射阿托品（0.05 毫克 / 千克，肌肉注射）以减少支气管分泌物，然后依次给予氯胺酮（15 毫克 / 千克，肌肉注射）和丙泊酚（6 毫克 / 千克，静脉注射）以诱导和维持麻醉。使用带有持续加热功能的标准手术台放置实验对象。持续监测心电图、心率、血氧饱和度（SpO2）、血压和直肠温度。

对三只猴子进行病毒注射，以在视前区表达 Gq 受体（AAV2/9-CamKIIa-hM3Dq-mCherry，滴度 1.86 × 10^(13)），一只未注射病毒的猴子（CM53–CON）作为对照。对于猴子 CM33–EXP 和 CM34–EXP，在视前区垂直上方安装一个带有多个导向孔的网格，然后在磁共振成像扫描后，通过导向网格可以获得准确的注射坐标。所有磁共振成像扫描均使用分辨率为 0.5 毫米的 3T 扫描仪进行 T1 加权图像扫描（3T Tim Trio 扫描仪）。使用 MPRAGE 序列，参数为 TR/TE = 2,100/3.18 毫秒，TI = 1,100 毫秒，翻转角度 = 8，矩阵 = 320 × 320，生成 240 层图像。

病毒注射按照其他地方详细描述的程序进行。简而言之，使用固定好的注射器和针头，以 200 纳升 / 分钟的速度将总共 6 微升的病毒双侧注射到视前区。将针头降低到目标深度后，我们等待 10 分钟让组织稳定下来，然后开始注射。注射完成后，再等待 10 分钟让病毒扩散，然后再拔出针头。

为了持续记录核心体温，按照标准手术程序，将温度记录仪（STAR-ODDI，micro-T）植入每只猴子的腹腔内并固定在腹壁上。为了避免手术引起的任何急性反应，在温度记录实验前至少给予实验对象 2 周的恢复时间。在所有记录阶段完成后，通过另一次手术取出记录仪，并缝合腹腔让实验对象恢复。

03. 温度记录

在注射 CNO / 生理盐水（CNO 二盐酸盐，10 毫克 / 千克，肌肉注射）前后，所有猴子的核心体温均由植入的记录仪记录。记录仪设置为在记录期间每 5 分钟记录一次。生理盐水和 CNO 在不同的日子注射，两次 CNO 注射至少间隔 7 天。记录在猴子自由活动或限制在猴椅上时进行。对于自由活动的情况，实验对象饲养在它们的饲养笼中。将注射 CNO / 生理盐水前 60 分钟的时间段作为基线，以计算核心体温变化量（ΔTc）。对于在猴椅上的情况，将实验对象从它们的饲养笼中取出并限制在定制的椅子上，以便它们只能进行轻微的活动。由于这些操作可能会导致核心体温的变化，因此使用更早的时间段（注射前−120∼−60 分钟）作为基线来计算 ΔTc。

在麻醉期间进行温度记录时，首先按照上述程序对动物进行麻醉，持续监测心率、血压和呼吸，然后将动物放在电热垫上并用毯子包裹。调整麻醉水平以确保始终没有捏趾反射和角膜反射。直肠温度通过放置在肛门内的热传感器记录 3 小时。将注射 CNO / 生理盐水前 15 分钟的时间段作为基线。

对于表面温度测量，猴子坐在固定在三脚架上的热像仪前。因此，在整个记录过程中，距离和视角可以保持相对一致。每 5 分钟同时拍摄一张热成像图和一张可见光图像。为了获得耳朵的平均温度，从红外图像中手动选择耳朵的轮廓，并使用软件进行分析。

04. 生理记录与分析

使用生理信号采集系统对受限制的实验对象记录心电图和肌电图。在实验前，在三个不同的日子里，让它们在椅子和记录室中适应至少 180 分钟。实验由相同的实验人员在相同的环境中、不同的日子、相同的时间进行。在实验期间，心电图和肌电图信号分别以 500 赫兹和 1000 赫兹的采样率持续记录至少 180 分钟。实验对象不需要执行任何任务，只需安静地坐在椅子上，并给予少量的水和食物奖励。

使用软件从心电图信号中提取心率。具体来说，将原始信号等距划分为 15 分钟的片段，从中选择一段 30 秒的稳定片段进行心率分析。将注射前 15 分钟的心率作为基线。在整个时间过程中目视检查肌电图信号，并手动选择波纹状信号进行进一步的功率谱分析。

在相同的生理记录阶段，当实验对象受限制时，在注射 CNO / 生理盐水后 40–50 分钟采集血样。然后，按照程序进行血常规检测、生化检测和电解质检测。

05. 活动量记录与分析

使用位于指定记录室的定制观察笼（100 × 100 × 100 厘米）记录注射 CNO 对自由活动动物的影响。观察笼的顶部和前部由钢化玻璃制成，以便直接进行视频记录，两个摄像头分别记录顶视图（x 和 y 维度）和侧视图（x 和 z 维度）。使用一个商业系统，该系统已在其他使用灵长类动物的研究中用于分析运动行为，来分析实验对象的活动并从记录的视频中提取运动数据。视频跟踪的采样率对于顶视图和侧视图均为 25 赫兹，同步进行。将所有 x、y 和 z 轴的跟踪数据归一化到 0–100 厘米，其中 x 表示从右到左，y 表示从前到后，z 表示从下到上。将猴子从它们的饲养笼转移到观察笼中，并单独记录，提供少量的水和食物奖励。在实验前，所有猴子都通过在观察笼中放置至少 1 小时，在三个不同的日子里适应了观察笼。在实验期间，记录实验对象行为的视频至少 180 分钟。使用定制代码从记录的数据中重建并量化移动轨迹。

为了量化生理盐水和 CNO 条件下移动距离的差异，首先提取每个 30 分钟片段的移动距离，为生理盐水和 CNO 条件生成六个数据点，然后将所有数据点通过生理盐水条件的平均值进行归一化。通过配对 t 检验进行统计分析。

06. 功能磁共振成像扫描与数据分析

按照上述程序对实验对象进行麻醉。使用 3T 扫描仪，通过一般设置（梯度回波，回波平面成像，重复时间（TR） = 3,000 毫秒，回波时间（TE） = 30 毫秒，翻转角度 = 90，层厚 = 1.5 毫米）获得血氧水平依赖（BOLD）信号。在注射 CNO（10 毫克 / 千克，肌肉注射）前进行基线扫描，然后在注射 CNO 后每 10 分钟重复扫描一次，共扫描九次。

使用基于 Matlab 的工具箱 DPARSFA（http://rfmri.org/DPARSF）对静息态功能磁共振成像数据进行预处理。简而言之，首先将数据从 DICOM 格式转换为 NIFTI 格式。在去除前五个时间点后，进行切片时间校正和配准。提取每个 T1 结构图像并与功能图像进行配准，然后使用 T1 图像统一分割模块将功能图像归一化到 112RM-SL 模板（DPARSFA 中的默认猴脑模板），并重新采样为体素大小为 2 × 2 × 2 毫米。

本研究共使用了 23 个感兴趣区域，其中 22 个取自 Paxinos_composite 子目录（http://brainimaging.waisman.wisc.edu/~converse/rhesusROIs/），并与 112RM-SL 模板（即标准空间感兴趣区域）对齐。第 23 个是视前区，根据每只猴子在个体空间中的 T1 结构图像，手动创建为成对的球形感兴趣区域。

预处理后，计算以下指标，并提取每个感兴趣区域的值以进行进一步的统计分析：

(1)局部一致性均值（mReHo）：使用肯德尔和谐系数以体素方式测量给定体素与其 26 个最近邻体素之间的时间序列同步性，来进行局部一致性（ReHo）计算。在去趋势和带通滤波（0.01–0.1 赫兹）后，为每个数据生成肯德尔和谐系数图，并除以全局平均值以获得 mReHo 图。对结果使用 2 毫米半高宽的高斯核进行平滑处理。提取标准空间中 22 个感兴趣区域的 mReHo 值，并通过减去注射前的值进行基线校正。

(2)低频振荡幅度均值（mALFF）/ 分数低频振荡幅度均值（mfALFF）：低频振荡幅度（ALFF）/ 分数低频振荡幅度（fALFF）被认为反映了大脑的自发波动和功能活动。为了计算 ALFF，首先对数据使用 2 毫米半高宽的高斯核进行空间平滑处理。使用快速傅里叶变换将时间序列转换到频域以获得功率谱。计算功率谱的平方根，然后在每个体素上对 0.01–0.1 赫兹范围内的值进行平均，从而生成 ALFF。为了获得 fALFF，将 0.01–0.1 赫兹范围内的幅度总和除以整个频率范围的幅度总和。为了进一步获得 mALFF/mfALFF，将所有 ALFF/fALFF 图除以它们的平均值。最后，提取 22 个标准感兴趣区域的 mALFF/mfALFF 值，并通过减去注射前的值进行基线校正。

(3)功能连接性（FC）：通过应用基于感兴趣区域的方法进行功能连接性分析。简而言之，首先在每个数据中进行空间平滑（2 毫米半高宽的高斯核）、去趋势和干扰协变量回归，以提高信噪比。应用带通滤波（0.01–0.1 赫兹）以去除功能连接性中的虚假波动。为每个感兴趣区域获得平均时间进程，并计算成对相关系数以指示每对感兴趣区域之间的功能连接性强度，然后通过减去注射前的值进行基线校正。

对于视前区，mReHo、mALFF/mfALFF 和 FC 的计算方法与上述类似，不同之处在于所有值是在个体空间而非标准空间中提取的。

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